Produtos
Kit de detección Lifecosm SARS-Cov-2-RT-PCR para 2019-nCoV
Uso previsto
Este kit utilízase para a detección cualitativa do novo coronavirus (2019-nCoV) mediante frotis farínxeos, frotis nasofarínxeos, líquido de lavado broncoalveolar e esputo. O resultado da detección deste produto é só para referencia clínica e non debe usarse como única evidencia para o diagnóstico e tratamento clínico. Recoméndase unha análise exhaustiva da afección en combinación coas manifestacións clínicas do paciente e outras probas de laboratorio.
Principio de inspección
O kit baséase na tecnoloxía RT-PCR dun só paso. De feito, os xenes ORF1ab e N do novo coronavirus de 2019 (2019-nCoV) foron seleccionados como rexións diana de amplificación. Deseñouse un cebador específico e sondas fluorescentes (as sondas do xene N están marcadas con FAM e as sondas ORF1ab están marcadas con HEX) para detectar o ARN do novo tipo de coronavirus de 2019 en mostras. O kit tamén inclúe un sistema de detección de control interno endóxeno (sonda xénica de control interno marcada con CY5) para monitorizar o proceso de recollida de mostras, ARN e amplificación da PCR, reducindo así os resultados falsos negativos.
Compoñentes principais
| Compoñentes | Volume(48T/Kit) |
| Solución de reacción de RT-PCR | 96 µl |
| Mezcla de sonda TaqMan de cebador nCOV (ORF1ab, xene N, xene RnaseP) | 864 µl |
| Control negativo | 1500 µl |
| nCOV control positivo (l ORF1ab N Gene) | 1500 µl |
Reactivos propios: reactivos de extracción ou purificación de ARN. Control negativo/positivo: o control positivo é o ARN que contén o fragmento diana, mentres que o control negativo é auga sen ácidos nucleicos. Durante o seu uso, deben participar na extracción e deben considerarse infecciosos. Deben manipularse e eliminarse de acordo coa normativa vixente.
O xene de referencia interno é o xene RnaseP humano.
Condicións de almacenamento e data de caducidade
-20 ± 5 ℃, evite conxelación e desconxelación repetidas máis de 5 veces, válido durante 6 meses.
Instrumento aplicable
Con FAM / HEX / CY5 e outros instrumentos de PCR fluorescentes multicanle.
Requisitos das mostras
1. Tipos de mostras aplicables: hisopos de gorxa, hisopos nasofarínxeos, líquido de lavado broncoalveolar, esputo.
2. Recollida de mostras (técnica aséptica)
Hisopo farínxeo: limpar as amígdalas e a parede farínxea posterior con dous hisopos ao mesmo tempo e, a continuación, mergullar a cabeza do hisopo nun tubo de ensaio que conteña a solución de mostraxe.
Esputo: Despois de que o paciente teña unha tose profunda, recóllese o esputo tosido nun tubo de ensaio con tapa de rosca que conteña a solución de mostraxe; líquido de lavado broncoalveolar: mostraxe por profesionais médicos. 3. Almacenamento e transporte de mostras
As mostras para o illamento de virus e as probas de ARN deben analizarse canto antes. As mostras que se poden detectar en 24 horas pódense almacenar a 4 ℃; as que non se poden detectar en 24 horas
horas deben almacenarse a -70 ℃ ou menos (se non hai condicións de almacenamento de -70 ℃, deben ser
almacenadas temporalmente a -20 ℃ no frigorífico). As mostras deben evitarse a conxelación e o desconxelación repetidos durante o transporte. As mostras deben enviarse ao laboratorio canto antes despois da recollida. Se é necesario transportar as mostras a longas distancias, recoméndase o seu almacenamento en xeo seco.
Métodos de proba
1 Procesamento de mostras e extracción de ARN (área de procesamento de mostras)
Recoméndase tomar 200 μl de mostra líquida para a extracción de ARN. Para coñecer os pasos de extracción relacionados, consulte as instrucións dos kits de extracción de ARN comerciais. Tanto a mostra negativa como a negativa
Os controis deste kit estiveron implicados na extracción.
2 Preparación de reactivos para PCR (área de preparación de reactivos)
2.1 Retire todos os compoñentes do kit e desconxéleos e mestúreos a temperatura ambiente. Centrifugue a 8.000 rpm durante uns segundos antes do seu uso; calcule a cantidade necesaria de reactivos e prepárese o sistema de reacción como se mostra na seguinte táboa:
| Compoñentes | Ración N (sistema de 25 µl) |
| Cebador de nCOV TaqMan probemixture | 18 µl × N |
| Solución de reacción de RT-PCR | 2 µl × N |
| *N = número de mostras analizadas + 1 (control negativo) + 1 (nCOV)control positivo) | |
2.2 Despois de mesturar completamente os compoñentes, centrifugar durante un curto período de tempo para que todo o líquido da parede do tubo caia ao fondo do tubo e, a continuación, alícuotar os 20 µl do sistema de amplificación no tubo de PCR.
3 Mostraxe (zona de preparación de mostras)
Engádense 5 μl dos controis negativo e positivo despois da extracción. O ARN da mostra que se vai analizar engádese ao tubo de reacción da PCR.
Tapar o tubo firmemente e centrifugar a 8.000 rpm durante uns segundos antes de transferilo á área de detección de amplificación.
4 Amplificación por PCR (área de detección amplificada)
4.1 Coloque o tubo de reacción na cela de mostra do instrumento e configure os parámetros do seguinte xeito:
| escenario | Ciclo número | Temperatura(°C) | Tempo | colecciónsitio |
| Inversotranscrición | 1 | 42 | 10 minutos | - |
| Predesnaturalizaciónn | 1 | 95 | 1 minuto | - |
| Ciclo | 45 | 95 | 15 segundos | - |
| 60 | anos 30 | recollida de datos |
Selección do canal de detección do instrumento: Seleccione o canal FAM, HEX, CY5 para o sinal de fluorescencia. Para a fluorescencia de referencia NONE, non escolla ROX.
5 Análise de resultados (Consulte as instrucións experimentais de cada instrumento para a configuración)
Despois da reacción, garde os resultados. Despois da análise, axuste o valor inicial, o valor final e o valor limiar da liña base segundo a imaxe (o usuario pode axustalos segundo a situación real, o valor inicial pódese configurar en 3~15 e o valor final pódese configurar en 5~20) no gráfico logarítmico. No limiar da xanela, a liña do limiar está na fase logarítmica e a curva de amplificación do control negativo é unha liña recta ou está por debaixo da liña do limiar.
6 Control de calidade (inclúese un control procedimental na proba). Control negativo: non se observa unha curva de amplificación evidente para os canais de detección FAM, HEX e CY5.
Control positivo de COV: curva de amplificación evidente dos canais de detección FAM e HEX, valor Ct ≤32, pero sen curva de amplificación do canal CY5;
Os requisitos anteriores deben cumprirse simultaneamente no mesmo experimento; se non, o experimento non será válido e deberá repetirse.
7 Determinación de resultados.
7.1 Se non hai unha curva de amplificación ou un valor Ct > 40 nos canais FAM e HEX da mostra de proba, e hai unha curva de amplificación no canal CY5, pódese xulgar que non hai ARN do novo coronavirus 2019 (2019-nCoV) na mostra;
.2 Se a mostra de proba ten curvas de amplificación evidentes nos canais FAM e HEX, e o valor Ct é ≤40, pódese xulgar que a mostra é positiva para o novo coronavirus de 2019 (2019-nCoV).
7.3 Se a mostra de proba ten unha curva de amplificación clara só nun canal de FAM ou HEX, e o valor Ct é ≤40, e non hai curva de amplificación no outro canal, os resultados deben ser repetidos. Se os resultados da repetición da proba son consistentes, a mostra pode considerarse positiva para o novo
coronavirus 2019 (2019-nCoV). Se o resultado da nova proba é negativo, pódese determinar que a mostra é negativa para o novo coronavirus de 2019 (2019-nCoV).
Valor do xuízo positivo
O método da curva ROC úsase para determinar o valor de referencia do CT do kit e o valor de referencia do control interno é 40.
Interpretación dos resultados das probas
1. Débese analizar cada experimento para detectar controis negativos e positivos. Os resultados das probas só se poden determinar cando os controis cumpren os requisitos de control de calidade.
2. Cando os canais de detección FAM e HEX son positivos, o resultado do canal CY5 (canal de control interno) pode ser negativo debido á competencia do sistema.
3. Cando o resultado do control interno é negativo, se os canais de detección FAM e HEX do tubo de ensaio tamén son negativos, significa que o sistema está desactivado ou que o funcionamento é incorrecto, polo que a proba non é válida. Polo tanto, é necesario volver analizar as mostras.
